Фармакологическая стратегия клеточных технологий


Чтобы посмотреть презентацию с оформлением и слайдами, скачайте ее файл и откройте в PowerPoint на своем компьютере.
Текстовое содержимое слайдов:

Российская академия медицинских наук Сибирское отделение Научно-исследовательский институт фармакологии ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ СТРАТЕГИЯ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ Академик РАМН А.М. Дыгай Схема дифференцировки мезенхимальной стволовой клетки Направления клеточной терапии:эмбриональные СКфетальные СКклетки пуповинной кровивыращенные in vitro ткани и органы и др. Зародыш Костный мозг Скелетные мышцы Сердце Поджелудочнаяжелеза Печень Головной мозг Региональные клетки-предшественники Несостоятельность механизмов регенерации глубокого резерва при патологических состояниях Анализ данных, полученных на различных моделях патологических состояний, показал во всех случаях развитие практически однотипных реакций со стороны резидентных СК и клеток-предшественников костного мозга, представляющего собой основное депо данных элементов в организме. Не зависимо от характера повреждений имела место активация мультипотентных прогениторных клеток гемопоэтической ткани, которая, однако, не сопровождалась их значительной мобилизацией в периферическую кровь. Механизмы регенеративных эффектов Г-КСФ Костный мозг Сердце Поджелудочнаяжелеза Головной мозг Г-КСФ Печень Действие препарата Г-КСФ на миграцию стволовых клеток МЕТАБОЛИЗМ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ ГИАЛУРОНИДАЗА играет ключевую роль в метаболизме гиалуроновой кислоты.Под влиянием фермента происходит расщепление ГК до ее низко- и среднемолекулярных форм, стимулирующих пролиферацию и дифференцировку клеточных элементов. Кроме того, ГК in situ в костном мозге связывает клетки-предшественники различной степени зрелости посредством расположенных на них CD44 и RHAMM – рецепторов. ГИАЛУРОНОВАЯ КИСЛОТА Представляет собой наиболее распространенный гликозаминогликан в организме, входит в состав межклеточного матрикса, кликокаликса клеток, рецепторов к биологическим регуляторам и связывает in situ клетки-предшественники посредством специфических рецепторов. Фундаментальные аспекты перспективы использования гиалуронидазы в регенеративной медицине СХЕМА МЕХАНИЗМОВ ВЛИЯНИЯ ГИАЛУРОНИДАЗЫ НА ПРОГЕНИТОРНЫЕ КЛЕТКИ Относительно низкие дозы гиалуронидазы способны существенно повышать функциональную активность клеток-предшественников, и потенцировать мобилизующую СК активность Г-КСФ. Происходит усиление мобилизующего действия Г-КСФ в отношении прогениторных элементов в 3 раза (содержание МСК в периферической крови увеличивалось до 1000,0% от фона) ПОКАЗАТЕЛИ СИСТЕМЫ КРОВИ У ЖИВОТНЫХ ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ 5-ФТОРУРАЦИЛА ПРИ ТРАНСПЛАНТАЦИИ МОНОНУКЛЕАРОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ, ПОЛУЧЕННЫХ ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ Г-КСФ И Г-КСФ СОВМЕСТНО С ГИАЛУРОНИДАЗОЙ КОЕ-Э КОЕ-ГМ Эритрокариоциты Продукция ЭПА прилипающими миелокариоцитами Нейтрофильные гранулоциты Продукция КСА прилипающими миелокариоцитами - контроль - трансплантация мононуклеаров, полученных после введения Г-КСФ - трансплантация мононуклеаров, полученных после введения Г-КСФ и гиалуронидазы Показана значительно более высокая эффективность трансплантанта, полученного после введения гиалуронидазы и Г-КСФ. При этом механизмами, лежащими в основе регенерации кроветворной ткани являлось не только увеличение пула кроветворных прекурсоров и возрастание их функциональной активности, но и восстановление гемопоэзиндуцирующего микроокружения костного мозга (особенно, его стромального компонента: повышение числа стромальных предшественников и усиление продукции гемопоэтинов прилипающими миелокариоцитами). ОСНОВНЫЕ НАНОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ СОЗДАНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ Основными задачами использования носителей являются: преодоление биологических барьеров, существующих в организме (кишечник – кровеносное русло, кровеносное русло – ткань);уменьшение побочных эффектов (токсичности, аллергенности);увеличение времени выведения лекарственного препарата из организма. Кроме того, представляется необходимым и активно исследуется проблема обеспечения адресной доставки лекарственных веществ, которая, однако, в настоящее время достаточно далека от ее практического решения. Неорганические вещества Органические вещества ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАНОЧАСТИЦ НЕОРГАНИЧЕСКОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ Факторы, предрасполагающие к высокой токсичности: - отсутствие в организме адекватных систем их биодеградации и выведениязначительная и неконтролируемая кумуляция в тканях - высокая проникающая способность- высокая реакционная способность- высокая каталитическая способность повреждение субклеточных структур, в том числе генетического аппарата в клеток - высокая адсорбционная способностьконтаминация вирусами Представляют наименьший интереснесут высокую потенциальную угрозу НАНОКОНСТРУКЦИИ НА ОСНОВЕ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ – ПЕГИЛИРОВАННЫЕ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА Neulasta: ПЕГилированый рчГКСФ для лечения нейтропений (Hoffman-La Roche);Mircera, «С.E.R.A.» (Hoffman-La Roche)Pegasys: ПЕГилированый альфа-интерферон-альфа для лечения хронических гепатитов С и В (Hoffman-La Roche);PEG-Intron: ПЕГилированый альфа-интерферон-бетта для лечения хронических гепатитов С и В (Schering-Plough / Enzon)Adagen (PEG-bovine adenosine deaminase) производства Enzon Pharmaceuticals, Inc.;Oncaspar: ПЕГилированая L -аспарагиназа для лечения острого лимфобластного лейкоза (Enzon).Doxil: ПЕГилированые липосомы с доксорубицином (Sequus) СТРУКТУРА ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЯ Никитин И. Г., Сторожаков Т.Н., 2003 Преимущества: физическая стабильность, растворимость, увеличение периода жизни в организме, низкая токсичность (иммуногенность) Недостатки: химический синтез является сложным многоступенчатым и дорогостоящим технологическим процессом, с применением высокотоксичных реагентов, требующих использование многочисленных стадий очистки с целью получения гомогенной популяции модифицированных молекул НАНОТЕХНОЛОГИЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ / ПЕГИЛИРОВАНИЯ/ ЭЛЕКТРОННО-ЛУЧЕВОГО СИНТЕЗА Преимуществами данных препаратов являются:- их максимально высокая эффективность, - низкая токсичность и иммуногенность (высокая безопасность), - альтернативные пути использования (пероральное применение),- уникальные специфические эффекты. Зарегистрирован: тромбовазим Закончены доклинические исследования: имм олигонуклеотиды, пегилин,имоцептПроводятся доклинические исследования: имм Г-КСФ имм гиалуронидаза имм алкалаза, имм СТГ, имм интерферон α-2β, имм интерлейкин-2, имм эритропоэтин Разработана:ООО «Саентифик фьючер менеджмент», Институт ядерной физики СО РАН, Институт цитологии и генетики СО РАН Хроматограмма (SEC-HPLC-хроматография) раствора субстанции рчГ-КСФ (0,7мг/мл) и полиэтиленгликоля (ПЭГ) до облучения и раствора рчГ-КСФ (0,7мг/мл) ) и ПЭГ после ионизирующего воздействия Электрофореграмма (SDS-PAAG электрофорез):дорожки 1,5 – исходного рчГ-КСФ, 20 мкл,дорожки 2,6 – облученного раствора рчГ-КСФ и ПЭГ, 40мкл, дорожки 3,7 - облученного раствора рчГ-КСФ и ПЭГ, 20 мкл,дорожка 4 – белков-стандартов «Сибэнзим». ИММОБИЛИЗИРОВАННЫЙ ГРАНУЛОЦИТАРНЫЙ КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩИЙ ФАКТОР Патент (RU) на изобретение № 2406528 «Средство для регенеративной медицины» (Бюл. № 35 от 20.12.2010). Авторы: Артамонов А.В., Бекарев А.А., Верещагин Е.И., Дыгай А.М., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н., Удут В.В. МЕХАНИЗМЫ ГЕМОСТИМУЛИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ имГ-КСФ КОЕ-ГЭММ КОЕ-ГМ КОЕ-Г - цитостатический контроль - стандартный Г-КСФ - имГ-КСФ КлОЕ-Г/КОЕ-Г КСА прилипающих клеток КОЕ-Ф 1 2 1 2 2 – имГ-КСФ 1 – стандартный Г-КСФ 2 1 Стимуляция процессов кроветворения под влиянием имГ-КСФ, в отличие от таковой при использовании неконъюгированного аналога, происходит в большей степени за счет активации «срочных» механизмов компенсации в результате воздействия препарата на «буферный отдел» регенераторного резерва гемопоэтической ткани с легко возобновляемыми ресурсами – коммитированные клетки-предшественники – КОЕ-ГМ и КОЕ-Г. -подкожное введение Г-КСФ - подкожное введение иммГ-КСФ МОБИЛИЗУЮЩИЕ СВОЙСТВА имГ-КСФ - пероральное введение иммГ-КСФ КОЕ-Ф, костный мозг МСК, костный мозг КОЕ-Э, костный мозг КОЕ-ГМ, костный мозг КОЕ-Ф, периферическая кровь КОЕ-ГМ, периферическая кровь КОЕ-Э, периферическая кровь МСК, периферическая кровь - контроль Процесс пегилирования цитокина с использованием нанотехнологии электронно-лучевого синтеза сопровождается повышением эффективности стимуляции выхода в кровь наиболее ранних родоначальных элементов - клеток, обладающих максимально высоким ростовым потенциалом ХРОНИЧЕСКИЙ ГЕПАТИТ, ЛЕЧЕНИЕ ПРЕПАРАТОМ имГ-КСФ КОЕ-Печ * на 100 тыс. клеток МСК, 3-и сутки на 1 млн. клеток * Применение имГ-КСФ практически не влияет на активность воспалительных процессов, но существенно снижает степень склерозирования печеночной ткани Количество клеток воспалительного инфильтрата (ед.) Относительная площадь соединительной ткани (%) * - контроль - введение имГ-КСФ SDF-1-фактор, стромальные миелокариоциты * * * * Cl4 Cl4+имГ-КСФ ФОН Мобилизация СК связана со снижением продукции стромальными клетками SDF-1-фактора ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКИЙ ПРОФИЛЬ им Г-КСФОпределение содержания Г-КСФ в сыворотке крови с помощью ИФА им Г-КСФ п/к Стандартный Г-КСФ п/к им Г-КСФ per os им Г-КСФ per os + им ГД Препарат плохо детектируется с помощью стандартных наборов для ИФА, в результате, по-видимому, снижения способности молекул Г-КСФ после конъюгации с носителем взаимодействовать со специфическими АТ. Однако, при прохождении через ЖКТ, очевидно, происходит вторичная модификация иммобилизированного фактора, которая, с одной стороны, повышает его способность связываться со специфическими АТ, что делает его доступным для обнаружения с помощью ИФА, но, с другой стороны, повреждает активный сайт белка, взаимодействующий с рецепторами КОНФОКАЛЬНАЯ МИКРОСКОПИЯ ТКАНИ ТОНКОЙ КИШКИ КРЫСЫ(накопление FITC-меченных препаратов) Контроль Препарат пегилированного белка Препарат нативного белка Всасывание пегилированных препаратов: через лимфатическую систему составляет около 40 % (с последующим транспортом по лимфатическому руслу в венозную систему).- через систему портальных вен (прямое всасывание в кровь) составляет около 20 %. ИММОБИЛИЗИРОВАННАЯ ГИАЛУРОНИДАЗА (гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидаза) ИмГД обладает выраженным резорбтивным фармакологическим влиянием в результате появления устойчивости у созданной конструкции к сывороточным и тканевым ингибиторам фермента. На сегодняшний день не известны вещества, оказывающие столь выраженное влияние одновременно на такое количество функций прогениторных элементов и механизмы их регуляции. ВЛИЯНИЕ ИММОБИЛИЗИРОВАННОЙ ГИАЛУРОНИДАЗЫНА ФУНКЦИИ ПРОГЕНИТОРНЫХ КЛЕТОК И МЕХАНИЗМЫ ИХ РЕГУЛЯЦИИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ГЕПАТИТЕ SDF-1-фактор, стромальные миелокариоциты, нг/мл SDF-1-фактор, клетки печени, нг/мл КОЕ-Ф, костный мозг КОЕ-Печ, печень КОЕ-Ф, периферическая кровь - Хронический гепатит - имГД Реакции со стороны прогениторных клеток развиваются на фоне резкого снижения выработки SDF-фактора стромальными клетками костного мозга, усиления его продукции элементами микроокружения печени и повышения способности самих клеток-предшественников к адгезии ХРОНИЧЕСКИЙ ГЕПАТИТ, ТЕРАПИЯ ИММОБИЛИЗИРОВАННОЙ ГИАЛУРОНИДАЗОЙ Применение имГД значительно снижало активность воспалительных процессов, оказывало антихолестатический эффект и предотвращало развитие склеротических процессов в печеночной ткани Количество клеток воспалительного инфильтрата (ед.) Относительная площадь соединительной ткани - контроль - имГД Щелочная фосфатаза сыворотки крови * * * * * * Печень крысы на 40-е сутки после шестикратного введения ССl4 препарат имГД(портальный склероз не выражен) без лечения(портальный склероз) ГК ГК ГК ГК ГЕМОПОЭТИЧЕСКАЯ ТКАНЬ(ТКАНЬ-ДЕПО СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК) ПОРАЖЕННАЯ ТКАНЬ (ОРГАН-МИШЕНЬ) SDF-1 SDF-1 SDF-1 SDF-1 МЕХАНИЗМЫ РЕГЕНЕРАТИВНОГО ДЕЙСТВИЯ ИММОБИЛИЗИРОВАННОЙ ГИАЛУРОНИДАЗЫ МСК SDF-1 SDF-1 SDF-1 SDF-1 SDF-1 имГД приводит к стимуляции процессов пролиферации и дифференцировки как регионарных стволовых клеток, так и прогениторных элементов тканей-депо. Причем активация последних сопровождается еще и их мобилизацией и направленной миграцией в органы-мишени. МОДИФИКАЦИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ПРОГЕНИТОРНЫХ КЛЕТОК К РАЗЛИЧНЫМ РОСТОВЫМ ФАКТОРАМ ПОД ВЛИЯНИЕМ ИММОБИЛИЗИРОВАННОЙ ГИАЛУРОНИДАЗЫ КОЕ-Печ печени, фактор роста стволовой клетки Мультипотентные предшественники костного мозга, ФРФ КОЕ-ГМ костного мозга, Г-КСФ КОЕ-Печ печени, инсулин - без преинкубации - преинкубация в 0,1%-растворе имГД 10 мин КОЕ-Ф печени, инсулин Предварительная обработка родоначальных клеток ферментом сопровождается значительным усилением колониеобразования. Как при отсутствии специальных добавок в питательной среде, когда колониестимулирующая активность определяется совокупностью биологически активных веществ эмбриональной телячьей сыворотки, входящей в ее состав. Так и при внесении в культуру специфических раннедействующих (фактор стволовой клетки, фактор роста фибробластов), линейно-рестриктированных (эритропоэтин, Г-КСФ) и пр. факторов роста (инсулин и др.). ОРИГИНАЛЬНЫЙ УНИВЕРСАЛЬНЫЙ ПОДХОД К ПОВЫШЕНИЮ ЭФФЕКТИВНОСТИ ТЕРАПИИ РАЗЛИЧНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПРЕПАРАТАМИ- АНАЛОГАМИ ЭНДОГЕННЫХ РЕГУЛЯТОРОВ ФУНКЦИЙ С ПОМОЩЬЮ ИММОБИЛИЗИРОВАННОЙ ГИАЛУРОНИДАЗЫ Система крови(цитостатическая миелосупрессия) Печень (хронический гепатит) Сахарный диабет РЕКОРМОН КОЕ-Э, костный мозг НЕЙПОГЕН КОЕ-ГМ, костный мозг Г-КСФ КОЕ-Печ, печень Относительная площадь соединительной ткани, % ИНСУЛИН Глюкоза крови, аллоксановый диабет Глюкоза крови, мыши линии СВА в возрасте 2 лет - физ.раствор - основной препарат - имГД - основной препарат + имГД гемопоэтические стволовые клетки мышей (CD3, CD45R (B220), Ly6C and Ly6G (Gr1), CD11b (Mac1), TER-119)-, Sca-1+, c-Kit+, CD34+ мезенхимальные стволовые клетки мышей CD44+, CD73+, CD90+, CD106+, CD31-, CD34-, CD45- ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ ПРИ ФИБРОЗЕ ЛЕГКИХ (интратрахеальное введение 80 мкг блеомицина) Изучение патогенеза фиброза легких показало стимуляцию дифференцировки СК в клеточные элементы фиброзной ткани ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ МОДИФИКАТОРОВ ФУНКЦИЙ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПРИ ФИБРОЗЕ ЛЕГКИХСодержание соединительной ткани в лёгких мышей после интратрахеального введения блеомицина (количество коллагеновых волокон от общей площади лёгочной ткани, %) - Спиперон (антагонист D2 дофаминовых рецепторов, α1B-адренергических рецепторов, 5-HT2A/5HT1 –серотониновых рецепторов) снижает содержание предшественников фиброзной ткани в легких; - Гиалуронидаза, помимо, описанных ранее на других моделях патологии эффектов обладает еще и способностью снижать уровень миграции гемопоэтических СК в пораженную ткань.- Совместное применении приводит к суммации их терапевтических эффектов- Г-КСФ на данной модели обладает провоспалительным действием и усугубляет развитие фиброзной ткани ГК ГК ГК ГК ГЕМОПОЭТИЧЕСКАЯ ТКАНЬ(ТКАНЬ-ДЕПО СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК) ПОРАЖЕННАЯ ТКАНЬ (ОРГАН-МИШЕНЬ) SDF-1 SDF-1 SDF-1 SDF-1 МФСК, имГД МСК SDF-1 SDF-1 SDF-1 SDF-1 SDF-1 ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА ДЛЯ РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЫ Наиболее значимых терапевтических эффектов за счет реализации программы систем клеточного обновления удается добиться при сочетанном использовании имГД с другими модификаторами функций СК МФСК Представленные данные свидетельствуют не только о принципиальной возможности, но и, безусловно, о высокой перспективности проведения клеточной терапии с помощью фармакологических агентов – модификаторов функций прогениторных клеток (МФСК) По материалам работ опубликовано:Монографий – 5Статей в реферируемых журналах – 97Защищено диссертаций:Докторских – 3Кандидатских – 5Получено патентов – 38Цикл работ удостоен международной премии Elsevier«SciVal / Scopus Award Russia 2012» (за создание Мирового кластера с отличительными компетенциями – нового высокоперспективного научного направления) НАУКОМЕТРИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!

Приложенные файлы


Добавить комментарий